J Neurosci︱郭伟翔课题组揭示Ⅱ型高赖氨酸血症的神经代谢紊乱的病理机制

撰文︱郭野，郭伟翔

责编︱王思珍

赖氨酸（Lysine）是必须氨基酸之一，哺乳动物体内不能合成，需要从食物中摄取，是机体生长发育等方面所必须的营养元素。机体摄入的赖氨酸可以通过两种途径降解，根据产生的中间产物分别命名为“酵母氨酸途径（saccharopine pathway）”和“哌啶酸途径（pipecolate pathway）”。酵母氨酸途径为赖氨酸ε-脱氨基途径，赖氨酸与α-酮戊二酸经赖氨酸-α酮戊二酸还原酶（lysine α-ketoglutarate reductase，LKR）催化合成酵母氨酸；后者经酵母氨酸脱氢酶（saccharopine dehydrogenase，SHD）催化生成α-氨基己二酸半醛（α-aminoadipate semialdehyde，AASA）和L-谷氨酸（L-Glutamate）（图1 A）。AASA经过多个步骤催化反应最终生成乙酰辅酶A。哌啶酸途径为赖氨酸α-脱氨基途径，赖氨酸经多步骤反应生成Δ1-哌啶-6-羧酸酯（Δ1-piperideine 6-carboxylate，P6C），P6C与AASA之间可以自发转换，进行后续的分解代谢。两种途径在AASA处交汇[1]。传统观点认为，酵母氨酸途径为肝脏等大脑以外器官中赖氨酸代谢的主要途径，而哌啶酸途径为大脑中赖氨酸代谢的优势途径。但是，随着研究的深入，根据放射性标记以及中间产物的测定结果，结合酵母氨酸途径中会产生脑内重要的兴奋性神经递质谷氨酸[2,3]，越来越多的研究人员认为在哺乳动物大脑中，酵母氨酸途径是有活性的，并且可能是脑内赖氨酸代谢的优势途径。

在酵母氨酸途径中，催化赖氨酸降解反应生成AASA的前两个步骤的酶，LKR和SDH分别位于双功能蛋白酶α-氨基半醛合成酶（α-aminoadipate semialdehyde synthase，Aass）的N端和C端，由基因Aass所编码[4]。Aass在哺乳动物脑中的表达和活性仍然是存在争议的。到目前为止，Aass介导的酵母氨酸途径在大脑发育过程中发挥怎样的功能仍然是未知的。

Aass突变造成的赖氨酸代谢异常会将导致机体赖氨酸及其代谢产物的积累，引起高赖氨酸血症，是一种常染色体隐性遗传病。Aass蛋白N端的LKR酶功能缺失导致Ⅰ型高赖氨酸血症，患者体内赖氨酸累积，但不会出现明显临床症状。而当LKR具有一定活性，而Aass蛋白C端的SDH酶功能失活时，将会导致Ⅱ型高赖氨酸血症，患者体内赖氨酸及酵母氨酸累积，伴随出现智力障碍等神经系统紊乱的症状[5]。

郭伟翔研究团队的前期成果中建立了LKR功能缺失Aass（R65Q）和SDH功能缺失Aass（G489E）的两种模型小鼠（图1 E）。与临床表型相一致的是，Aass（R65Q）小鼠除体液中赖氨酸水平显著上调之外，与野生型（WT）小鼠没有明显区别；Aass（G489E）小鼠体液中赖氨酸和酵母氨酸的水平均显著上升，小鼠肝脏线粒体结构和功能受损，肝肿大，小鼠表现为出生后生长发育迟缓，并在出生后4-6周内死亡[6]。尽管酵母氨酸异常积累与肝脏线粒体结构和功能之间的联系已经明确，但两种类型高赖氨酸血症在脑发育不良相关表型上存在显著差异。高赖氨酸血症患者中明显的赖氨酸代谢异常的生化指标异常与神经系统紊乱的表型与之间的关联仍然是需要深入的探讨和研究的问题。

2022年2月8日，中国科学院遗传与发育生物学研究所的郭伟翔课题组在Journal of Neuroscience上发表了题为“The metabolite saccharopine impairs neuronal development by inhibiting the neurotrophic function of glucose-6-phosphate isomerase”的研究论文，提出赖氨酸分解代谢异常导致小鼠脑内中间产物酵母氨酸累积，后者结合并抑制葡萄糖-6-磷酸异构酶的分泌性细胞因子功能，进而损伤神经元树突发育。该论文首次提出了Ⅱ型高赖氨酸血症患者中神经系统表型的潜在致病因素和相关分子机制，并从遗传学角度证明赖氨酸经酵母氨酸降解的途径在脑中是存在的，且对神经发育有重要意义。郭野博士为论文第一作者，郭伟翔研究员为论文通讯作者。

小鼠脑中酵母氨酸代谢途径是否存在及活跃程度仍然是存在争议的，对小鼠大脑发育的影响也是不清楚的。研究人员利用LKR功能缺失Aass（R65Q）和SDH功能缺失Aass（G489E）的两种模型小鼠（图1 E），针对赖氨酸代谢途径缺陷对大脑皮层发育的影响进行深入研究。

研究人员首先在mRNA水平及蛋白水平确认Aass在小鼠脑内表达（图1 B, C）。随后对小鼠大脑皮层匀浆内赖氨酸及酵母氨酸水平进行检测。与WT小鼠相比，在Aass(R65Q)鼠脑中检测到赖氨酸的浓度显著升高，没有检测到酵母氨酸的存在；而在Aass（G489E）鼠脑中检测到赖氨酸和酵母氨酸均异常积累（图1 F, G），确认哺乳动物大脑内赖氨酸确实可以经过酵母氨酸途径进行分解代谢。

研究人员分别取WT、Aass（R65Q）和Aass（G489E）小鼠的鼠脑进行分析，结果发现，Aass（G489E）小鼠鼠脑的重量显著降低，皮层厚度显著下降，而WT和Aass（A65Q）小鼠之间是没有明显差异的（图1 H-K）。进一步分析表明，Aass（G489E）小鼠鼠脑皮层厚度下降与胚胎期神经发生、板层结构和细胞凋亡等因素是无关的。

图1 SDH突变导致小鼠鼠脑减小

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

为了找到产生这种缺陷的原因，研究人员将Aass（R65Q），Aass（G489E）小鼠分别与thymocyte antigen 1 (Thy1)-GFP 转基因小鼠进行杂交，随机标记大脑皮层中的兴奋性椎体神经元，并对神经元的树突形态进行统计分析。结果发现，与WT相比，Aass（G489E）小鼠皮层中Layer II及Layer Ⅴ中GFP⁺神经元的底树突（basal dendrite）的长度和复杂程度显著下降，而Aass（R65Q）神经元底树突没有明显变化（图2）。体外分离培养三种基因型小鼠的海马神经元同样表现出与体内一致的现象（图3 A-F）。以上实验结果表明，Aass蛋白的SDH结构域功能缺失会细胞自主性的损伤神经元树突发育，进而导致Aass（G489E）小鼠鼠脑皮层厚度下降。

图2 SDH突变导致神经元树突发育损伤

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

为了探究Aass（G489E）小鼠中神经元树突形态缺陷是否是由酵母氨酸积累直接导致的，研究人员采用致病浓度的酵母氨酸和赖氨酸分别处理原代培养的WT神经元，14天后进行形态分析。结果发现，高浓度的酵母氨酸处理导致神经元树突长度和复杂程度显著下降，而高浓度的赖氨酸处理对神经元树突发育没有影响（图3 G-L）。综上所述，Aass蛋白SDH结构域的突变会阻断酵母氨酸代谢，造成其在小鼠脑内的异常累积，进而影响神经元的树突发育；这可能是II型高赖氨酸血症患者表现出的智力障碍等神经功能紊乱的致病原因之一。

图3 酵母氨酸损害神经元树突发育

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

为了阐明异常积累的酵母氨酸损伤神经元树突发育的分子机制，研究人员利用药物亲和反应靶点稳定性分析技术（drug affinity-responsive target stability analysis，DARTS）筛选酵母氨酸在鼠脑中的潜在靶点分子。质谱分析和后续的验证性实验均表明，酵母氨酸能够结合葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphate isomerase，GPI），在DARTS实验中被有效的保护其不被蛋白酶降解（图4）。

图4 DARTS筛选酵母氨酸潜在靶点

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

GPI是一种的多功能蛋白。在细胞内，GPI参与糖酵解过程，催化葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。同时，GPI能够分泌到细胞外，作为一种自分泌细胞因子调控细胞增殖、迁移等过程，参与调控神经元的存活和突起生长[7]。在此，研究人员发现，高浓度的酵母氨酸仅仅轻微的降低GPI的酶催化活性，而赖氨酸对此没有影响（图5 A-E）。糖酵解应激压力测试结果表明，WT、Aass（R65Q）和Aass（G489E）三种基因型的神经元的糖酵解能力没有变化（图5 F-I）。随后，研究人员对GPI的神经营养因子功能进行评估。结果表明，与培养的WT和Aass（R65Q）神经元相比，Aass（G489E）神经元的胞外GPI水平显著下降（图5 M, N）。以上结果表明，Aass（G489E）突变造成的积累的酵母氨酸可能结合GPI并降低其向细胞外的分泌。

图5 SDH突变导致胞外GPI水平下降

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

GPI对神经元树突发育的影响是不清楚的，作者通过外源添加重组GPI蛋白，或者GPI特异性抑制剂6-磷酸葡萄糖酸（6-Phosphogluconate，6PG）处理体外培养的原代神经元，分析神经元树突的形态变化。结果发现，重组GPI处理使神经元树突的长度和复杂程度显著上调；反之，6PG处理抑制神经元树突的生长发育。6PG处理Aass（G489E）神经元并不会使其树突发育受到进一步的损害，提示GPI作为酵母氨酸下游分子参与神经元树突发育的调控。进一步，补救实验表明，向Aass（G489E）神经元中外源加入重组GPI处理，能够补救其树突发育缺陷的表型（图6）。GPI添加及抑制均不会对神经元的糖酵解过程造成影响。

图6 外源添加GPI能够补救SDH突变导致的树突发育缺陷

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

图7 模式图 SDH突变导致酵母氨酸积累，通过抑制GPI的胞外功能损害神经元发育

（图源：Guo Y et al., J Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究结果证明Aass蛋白的SDH结构域突变造成赖氨酸代谢毒性中间产物——酵母氨酸的异常累积，损伤神经元的树突发育。机制分析表明，异常积累的酵母氨酸结合并抑制GPI的胞外分泌，通过抑制其神经营养因子功能导致Aass（G489E）神经元树突发育异常（图7）。

赖氨酸经酵母氨酸途径降解对哺乳动物大脑发育的影响是未知的。高赖氨酸血症患者中临床生化指标的异常与其表现出的神经系统功能紊乱之间的联系也仍然是值得深入探讨的问题。此研究中证明催化赖氨酸降解的α氨基半醛合成酶Aass的LKR结构域失活导致小鼠皮层中赖氨酸水平上升，但鼠脑发育是正常的。与之相对的，Aass的SDH结构域失活导致小鼠皮层中赖氨酸和酵母氨酸的含量均显著升高，鼠脑体积减小，神经元树突发育异常。积累的酵母氨酸通过抑制GPI的胞外分泌及神经营养因子功能损伤大脑神经发育（图7）。

此研究提供直接证据证明酵母氨酸途径在鼠脑中是存在的，并且对其发育具有重要作用。异常积累的酵母氨酸对神经发育造成的负面影响可能是II型高赖氨酸血症患者神经系统功能紊乱的致病原因之一。而高浓度赖氨酸对哺乳动物脑发育似乎是没有影响的。由此可以推论，药物抑制LKR活性，阻断酵母氨酸的产生，可能是治疗II型高赖氨酸血症等赖氨酸代谢相关遗传疾病的有效手段。这一假设需要更多的理论研究支持，针对LKR的抑制剂的研发及安全性评价也是未来研究方向之一。

总之，此研究提出赖氨酸代谢相关遗传疾病中的神经系统功能紊乱的潜在致病机理，并为相关疾病的治疗手段的研发提供理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1459-21.2022

郭伟翔研究员（左），通讯作者；郭野博士（右），第一作者。

（照片提供自：郭伟翔课题组）

中国科学院遗传与发育生物学研究所助理研究员郭野为本文第一作者，郭伟翔研究员为本文通讯作者。该工作得到了国家重点研究发展计划、国家自然科学基金和博士后科学基金的支持。郭伟翔团队致力于神经干细胞和神经发生的细胞分子机制研究，以及它们在神经退行性疾病和神经发育疾病的发生机制，从而为这些疾病的预防和治疗提供理论据。近五年来在Neuron、Cell Stem Cell、Nature Communication、Cell Reports、Molecular Psychiatry，Journal of Cell Biology、Journal of Neuroscience等杂志发表论文多篇。

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制版︱王思珍

本文完